脱落酸（Abscisic Acid，ABA）是植物重要内源激素，参与气孔调节、种子休眠、逆境响应、衰老调控等生理过程。相比 ELISA 易受基质干扰、HPLC 灵敏度不足的短板，液相色谱 – 串联质谱（LC-MS/MS）结合同位素内标法是目前植物 ABA 定量的金标准方法，定性准确、抗干扰强、检出限低，适合植物组织中微量脱落酸精准检测。
一、实验原理
核心为液相色谱分离 + 串联质谱检测 + 同位素内标校正。
1. 样品前处理提取植物内源 ABA，在提取早期加入同位素标记脱落酸（如 ²H₆- ABA）作为内标。同位素内标和天然 ABA 化学性质几乎完全一致，在提取、净化、色谱分离、质谱电离过程中的损失程度基本相同。通过内标校正，可以抵消前处理回收率波动、仪器信号漂移带来的误差。
2. 样品经液相色谱（LC）分离：流动相携带样品进入色谱柱，依靠天然 ABA 与基质杂质在色谱柱上保留能力差异实现组分分离。
3. 分离后的组分进入串联质谱（MS/MS）：在离子源电离，母离子经碰撞碎裂产生特征子离子。选择特征离子对（多反应监测 MRM 模式）进行采集，依靠保留时间 + 离子对信息双重定性；以内标峰面积比值建立标准曲线，完成 ABA 精准定量。
简单理解：同位素内标相当于自带参照物，跟着样品全程走一遍实验，用来校正实验过程中的损耗，让结果更可靠。
二、实验试剂、耗材与仪器
试剂
1. 天然 ABA 标准品（用于配制标准工作液，建立标准曲线）；2. 同位素标记内标：²H₆-ABA（同位素丰度合格，提前配制成母液，-20℃ 避光保存）；3. 提取溶剂： 乙腈/甲醇（色谱纯，激素提取常用乙腈）；4. 净化试剂：无水硫酸镁、氯化钠、C18 吸附剂、PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，去除有机酸、多酚、色素基质干扰）；5. 流动相：甲醇/乙腈、超纯水、甲酸（色谱纯，用于改善 ABA 离子化效率）；6. 其他：液氮。
耗材
研磨管、陶瓷研磨珠、离心管、移液枪头、有机相滤膜（0.22 μm）、进样小瓶、 内插管。
仪器
组织研磨仪、高速冷冻离心机、氮吹仪、超高效液相色谱、串联质谱仪。
三、实验操作步骤
1. 样品采集与保存
采集新鲜植物组织（叶片、根、种子、果实等），取样后迅速液氮速冻，转移至 – 80℃ 低温冰箱保存，抑制 ABA 降解。避免反复冻融。
2. 样品研磨与提取（提取阶段加入同位素内标）
（1）称取冷冻植物样品，放入研磨管，加研磨珠，液氮低温研磨成粉末；（2） 立刻加入预冷乙腈提取液，精准加入同位素内标工作液；（3）涡旋振荡，低温避光浸提；（4）加入盐析包（无水硫酸镁+氯化钠），剧烈涡旋，低温离心，分层后取上层有机相；（5）沉淀可重复提取一次，合并有机相，提高提取回收率。
3. 样品净化（QuEChERS 净化，植物样品常用）
取有机相，加入 C18、PSA 吸附剂，涡旋混匀，低温离心；吸附剂可吸附叶绿素、多酚、多糖等基质杂质，降低基质效应。离心后取上清。
4. 浓缩与定容
上清液转移至氮吹管，温和氮吹至近干（不要完全吹干，防止 ABA 损失）；用初始流动相复溶，涡旋；溶液经 0.22 μm 有机滤膜过滤，转移至 LC-MS 进样小瓶待测。
5. 标准曲线配制
将天然 ABA 标准品梯度稀释成系列浓度，每个标样中加入等量同位素内标，和待测样品保持一致。上机检测，以 ABA 峰面积/同位素内标峰面积为纵坐标，ABA 浓度为横坐标绘制标准曲线。
6. LC-MS/MS 上机检测
（1）液相色谱：流动相梯度洗脱，ABA 与杂质依次分离；（2）质谱：MRM 模式采集 ABA 与 ²H₆-ABA 对应的离子对；（3）数据处理：软件识别保留时间与特征离子，用内标法计算样品中 ABA 含量。
四、关键注意事项
1. 样品稳定性，全程控温避光：ABA 对温度、光照敏感，易氧化分解。取样速冻，研磨、提取、氮吹尽量低温操作；氮吹温度不宜过高，建议 ≤30℃。样品严禁反复冻融，否则结果偏低。
2. 同位素内标添加时机：内标一定要在提取第一步加入，不能在前处理完成后再加。只有同步参与提取净化，才能校正全过程损失。
3. 基质效应控制:植物组织色素､多酚含量高,会造成离子抑制/增强,影响质谱信号｡叶绿素多的叶片样品净化步骤不可省略;必要时可做基质匹配标准曲线进一步校正基质效应｡
4. 试剂与器皿要求：溶剂必须色谱纯；离心管、进样瓶尽量选用低吸附材质，减少 ABA 吸附损失；玻璃器皿建议清洗烘干，避免残留污染。
5. 质谱参数与离子对：定期调谐质谱，保证离子源状态稳定；ABA 与同位素内标使用各自专属离子对，避免交叉干扰；每批次样品穿插质控样（QC），监控数据稳定性。
6. 氮吹操作：氮吹气流不可过大，近干时降低气流，完全吹干会造成 ABA 不可逆吸附损失，导致结果偏低。
7. 标准品储存：ABA 标准品、同位素内标母液分装避光 -20℃ 保存，减少反复开盖冻融；定期核查标准品有效性。
五、方法优势科普
同位素内标：抵消前处理损失与质谱信号波动，定量准确度远高于外标法；LC-MS/MS：保留时间 + 特征离子双重定性，区分 ABA 及其结构类似物，避免假阳性；灵敏度高：适合微量内源激素检测，少量植物组织即可完成测定；局限： 仪器昂贵，样品前处理步骤较多，检测成本高于 ELISA，不适合超大量样品快速初筛。
六、应用场景
常用于作物干旱/盐胁迫生理研究、种子休眠机理、果实发育与采后生理、抗逆育 种材料内源激素精准定量等科研项目。
本文仅供参考，具体实验参数请根据实验室仪器型号及参考文献进行优化。
